一、核酸提取的核心方法

1. 酚-氯仿抽提法
   • 原理：利用裂解液破壞細(xì)胞釋放核酸，通過酚-氯仿去除蛋白質(zhì)，乙醇沉淀DNA。
   • 特點：
     • 優(yōu)點：核酸純度高，可同時分離DNA和RNA。
     • 缺點：操作繁瑣，使用有毒試劑（苯酚、氯仿），RNA易降解，對操作要求高。
   • 適用場景：對純度要求極高的實驗（如基因克隆、測序）。
2. 柱式提取法
   • 原理：核酸在高鹽條件下結(jié)合硅膠膜，雜質(zhì)被洗脫，最后用低鹽緩沖液洗脫核酸。
   • 特點：
     • 優(yōu)點：操作簡便快速，純度高，適合PCR、qPCR等下游應(yīng)用，安全性高（無毒試劑）。
     • 缺點：對低DNA濃度樣本回收率可能較低。
   • 適用場景：常規(guī)樣本（如血液、組織）的快速提取。
3. 磁珠法
   • 原理：表面修飾的磁性微珠與核酸結(jié)合，通過磁場分離雜質(zhì)，最后洗脫核酸。
   • 特點：
     • 優(yōu)點：高通量、自動化兼容性強(qiáng)，適合大規(guī)模樣本處理，純度好，適合高靈敏度檢測。
     • 缺點：試劑成本較高。
   • 適用場景：臨床診斷、高通量測序等需要大規(guī)模處理的場景。

二、樣本處理與核酸純化關(guān)鍵步驟

1. 樣本采集與裂解
   • 采集：根據(jù)樣本類型（血液、組織、細(xì)胞等）選擇合適方法（如抗凝管采血、無菌拭子采集）。
   • 裂解：使用裂解液（含蛋白酶K、SDS等）破壞細(xì)胞或病毒，釋放核酸。
2. 結(jié)合與洗滌
   • 結(jié)合：加入乙醇后，將混合物加載到核酸純化柱或磁珠中，核酸結(jié)合到硅膠膜或磁珠表面。
   • 洗滌：用洗滌緩沖液去除蛋白質(zhì)、鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。
3. 洗脫與保存
   • 洗脫：用低鹽緩沖液（如ddH?O或TE）洗脫核酸，得到純凈DNA/RNA。
   • 保存：避免反復(fù)凍融，防止核酸降解（如RNA需-80℃保存）。

三、質(zhì)量控制與優(yōu)化

1. 避免污染
   • 使用無核酸酶的試劑和耗材，操作時戴手套、口罩，避免說話、咳嗽。
   • 設(shè)置陰性對照（如無模板對照）監(jiān)測污染。
2. 保證核酸完整性
   • 提取RNA時避免RNase污染，操作輕柔，避免劇烈震蕩。
   • 使用DNase I處理樣本中的基因組DNA（如提取RNA時）。
3. 優(yōu)化提取條件
   • 根據(jù)樣本類型和實驗需求選擇合適方法（如低DNA含量樣本優(yōu)先選磁珠法）。
   • 調(diào)整裂解時間、洗滌次數(shù)等參數(shù)以提高回收率和純度。
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